揭开神秘面纱！对天然cfDNA甲基化识别和片段分析可揭示起源组织及核小体特性

发表时间：2022-09-29 09:56

使用 Oxford Nanopore 的短读长测序模式，首次在天然细胞游离 DNA 中识别到标志化的甲基化情况，由此可推导出全基因组甲基化模式。

循环血液中存在从细胞中裂解出的细胞游离DNA 短片段

细胞游离 DNA (cfDNA) 存在于几种不同体液中，是一种片段化、无细胞 DNA。有说法认为，外周血中的 cfDNA 是在细胞死亡期间通过凋亡或坏死进入循环血液的（图 1a）。在癌症中下，健康组织和肿瘤组织均会释放 cfDNA 到循环血液中。在保护 cfDNA 免受核酸酶降解方面，核小体复合体起到一部分作用。这种“足迹”可在片段长度分布图中看到：长度在 150-200 bp 及其倍数之间紧密分布（图 1b）。cfDNA 降解的半衰期在数小时范围内，新鲜外周血的正确处理是关键（图 1c）。

图1 CfDNA a) 进入循环血液 b) 核小体复合体 c) 实验室工作流程

cfDNA 的提取和测序揭示了特征性的核小体足迹

我们使用乙二胺四乙酸 (EDTA) 真空管采集了四份血样，每份抽血 10 ml，然后使用 Qiagen ccfDNA midi 试剂盒提取了 cfDNA。Agilent 轨迹显示出预期内的 167 bp 峰，这是从单个核小体复合体中释放的 DNA，而多个后续峰表明 DNA 从多个核小体中释放（图 2a）。在每份提取平行样中，cfDNA 的典型产量约为 9 ng/ml 血浆（图 2b），而每次 PromethION^TM 测序运行使用 30 ng cfDNA 输入。使用 minimap2 将测序读长序列与 HG38 参考基因组比对，比对长度显示的 DNA 分别对应于单个、两个和多个核小体的结合足迹（图 2c）。

图2 a) cfDNA 的已比对读长长度 b) 每 ml 血浆的 cfDNA 产率

天然 cfDNA 的甲基化识别可用于预测起源组织

对天然基因组细胞游离 DNA 进行纳米孔测序，可直接检测到 5mC 等碱基修饰。此处使用短读长模式结合 Remora，在碱基对分辨率下首次在天然 cfDNA 中检测到了 5mC。cfDNA 中的甲基化模式特别受关注，因为不同组织均有其特征性的甲基化标记，而甲基化模式变化被认为是癌组织中最早可测量到的差异之一。我们使用全基因组规模的甲基化模式，确定了特定组织产生的测序读长序列比例，并将特定位置的甲基化碱基比例作为 meth atlas 程序的输入值（图 3a）。此外，我们在 bam 文件中添加了单分子、单碱基分辨率的甲基化标记，以便于在 IGV 中进行可视化（图 3b）。

图3 cfDNA 中的甲基化模式 a) 识别甲基化 b) IGV 中显示的标记

核小体定位可用于识别基因组特征周围的开放和闭合染色质

片段组学利用 cfDNA 片段长度及其比对位置来鉴定组织或疾病状态和基因组特征。由于核小体与 DNA 的结合是非随机的，可用一个滑动窗口内的序列数量减去末端在该窗口中的序列数量，计算出窗口化保护评分，用于识别核小体结合位置（图 4a）。在 α-卫星阵列中，核小体的结合模式是可预测的。使用窗口化保护评分并与核小体的已知位置进行对比，可以准确预测核小体位置（图 4b）。核小体间距可用于识别染色质开放和闭合区域，为基因表达提供了一个代表 (proxy)。在所示的实例中，可在 CTCF 结合位点（正交显示为 DNAse I 超敏感区域）周围识别到一个染色质开放区域（图 4c）。

图4 核小体在 b) α-卫星阵列和 c) DNAse I 超敏感区域中的位置

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