邵春奎教授:挖掘CTC的蛛丝马迹,打造肿瘤早筛利器

发表时间:2022-01-04 09:36


CTC与肿瘤有何关系?
CTC肿瘤检测的临床应用如何?
CTC在检测过程中需要攻克哪些难点?



关于CTC的热点话题,中山大学附属第三医院病理科主任邵春奎教授在2021年中国肿瘤标志物学术大会暨第十五届肿瘤标志物青年科学家论坛(CCTB)上进行了详细分享。

“液体活检,是实现肿瘤精准医疗的重要基石。”邵教授表示。

液体,指体液,如血液、唾液、尿液等。液体活检,即基于这些体液样本的一种活检方式。

当前,液体活检主要有三大标志物应用于临床:循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)及外泌体(exosome)。

他们仨被称为液体活检的“三驾马车”。其中,CTC“起跑”稍早。


CTC会像种子一样生根发芽


1869年,澳大利亚籍医生Ashworth首次在癌症患者血液中发现并首次提出CTC的概念。

CTC(circulating tumor cell)是肿瘤在生长过程中,向血液循环中释放的肿瘤细胞。在肿瘤发生发展的各个阶段,均可有CTCs入血,且外周血中CTCs数量的多少,与肿瘤活性密切相关。

到1889年,英国学者Paget提出“种子与土壤”的假说。这刷新了当时人们的认知,也为后来人们研究肿瘤转移拓展了思路,至今仍有重要意义。

他假设,肿瘤细胞可以像种子一样四处撒播,并选择在体内肥沃的微环境“土壤”中野蛮生长。这个“土壤”由肿瘤周围的细胞和非细胞组分构成,它们相互作用,促进肿瘤的生长。

我们可以想象,CTCs也和“种子”一样,可以随着血液循环穿过血管,种植到其他部位。

在入血过程中,这些“种子”入侵第二器官,“摇身一变”,成为播散肿瘤细胞(DTC,Disseminated Tumour Cell),继续祸害其他组织和器官。

不过,邵春奎教授指出,外周血中检出CTCs,不等于肿瘤发生转移,而是提示发生远处转移的可能。

应该说,只有具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶,才能发展成为肿瘤远端转移。套用Paget的话可以说,“种子”得“生根发芽”了,才有转移一说。

图源:包图网

另外,有研究显示,肿瘤早期生长至17-18周时,长到约2mm,已在血管中检测到CTCs。

以上种种表明,通过高灵敏度的技术,检测出患者外周血中的CTCs,从而实现肿瘤的早期监测与诊断,理论上是大有可为的。

CTC检测渐趋成熟,获多个指南认可


CTC从发现到临床探索验证,已有150多年历史,研究渐趋成熟。

如今,CTC已被纳入国际肿瘤分期标准,获得多个指南认可。

比如,2017年,美国癌症联合委员会(AJCC)《肿瘤分期指南》(《Cancer Staging Manuel》)第8版指出,CTC作为一个新的M分期标准,作为cM(i+)出现在M0和M1之间,显示“无论早期还是转移癌患者,CTC的数量和生存期密切相关”。

以及,美国国立综合癌症网络《肿瘤指南-乳腺癌》(2017年)第4版中,“无临床和影像学证据,但血液中检测出CTC的患者划分为cM0(+),出现在M0和M1之间”。

近年来,我国各级专家共识也陆续纳入CTC。

今年发布的《结直肠癌分子标志物临床检测中国专家共识》指出,CTC对于结直肠癌的早期筛查、预后判断和疗效评估有一定作用。综合分析CTC细胞计数及其分子分型,可以为全面评估肿瘤状态和肿瘤精准诊疗提供重要的实时信息。

图源:邵春奎演讲PPT

CTC检测面前的两座大山


邵春奎教授表示,CTC检测仍是一项有挑战性的工作,需要攻克两大难关:稀有性和异质性。

稀有性:血液中CTC数量极少,与有核细胞数量比约为1/106-107,难以富集和分离。

异质性:CTC来源于肿瘤组织,具有肿瘤的特性。但经细胞分裂增殖多次后,其细胞大小、形态和基因表达等特征并不完全一致。有数据显示,CTC较原发肿瘤异质化程度高15倍。

要对CTC进行检测分析,主要有两大步骤。第一步是富集,目的是找到并捕获CTC;第二步是鉴定分析,目的是对富集的CTC进行特异性识别与判读。


(一)CTC的富集方法


常见的富集方法主要有滤膜法ISET、免疫磁珠(正向、负向富集)和微流控技术。


滤膜法ISET:采用直径8μm滤膜来回收CTC,操作简单,成本低廉。

免疫磁珠正向富集:基于CTC表面抗原设计磁珠,通过免疫反应富集高纯度的CTC。

免疫磁珠反向富集:基于血液中的白细胞表面抗原设计抗体磁珠,通过免疫反应最大限度去除白细胞,实现最大限度保留CTC。

微流控技术:样本量少,可实现高通量。但目前尚处于临床验证阶段。


国内目前有两个获批的CTC富集系统,分别是华得森生物的CytoSorter®CTC检测系统和德路通循环上皮细胞采集器CellCollector。


华得森生物的CytoSorter®CTC检测系统于2021年7月份获批,是国内第一张CTCⅢ类注册证产品。


该系统基于微流控和免疫捕获技术,需与获批的配套试剂盒配合使用。在临床上用于对人外周血来源的循环上皮源肿瘤细胞进行分离富集,以及后续的细胞鉴定分析和伴随诊断的临床应用。


德路通循环上皮细胞采集器CellCollector由德国Gilupi公司研发生产,于2012年底获CE认证、2017年5月获国家药监局(NMPA)Ⅲ类认证。


该产品采用纳米涂层技术,利用抗原抗体免疫反应,从患者外周血中捕获CTC,可用于复发转移性乳腺癌患者采集外周血循环上皮细胞的监测分析。





(二)CTC的分析方法


常见的鉴定分析方法主要基于细胞表面抗原、细胞内特异基因序列和基于肿瘤细胞特异性表面叶酸抗体。


基于细胞表面抗原:基于CTC表面特异性抗原(EpCAM、HER2等),通过免疫荧光染色(IF),并在显微镜下观察CTC。

基于细胞内特异基因序列:FISH、靶向PCR、二代测序、RT-PCR、基因表达谱等。

基于肿瘤细胞特异性表面叶酸受体(FR):FR与标记探针结合,切下结合探针的MicroDNA进行定量扩增,通过扩增曲线计算CTC数量。


据不完全统计,世界范围内CTC检测产品目前有四五十个。


强生的CellSearch是全球首个商用的CTC检测产品,在2004年由FDA批准上市,2012年获MNPA批准。


该系统基于EpCAM的免疫磁珠正向富集CTC,采用荧光免疫技术进行分析检测,主要用于对恶性肿瘤患者进行动态监测,辅助判断疾病进程或治疗效果。


格诺生物的叶酸受体阳性CTC检测技术(以下简称FR+CTC),则是国内首个获得NMPA批准的Ⅲ类注册证的CTC检测试剂。FR+CTC于2016年获批,2020年12月成功续证,涵盖了CTC富集和分析的一体化检测试剂。


该技术基于免疫磁珠负向富集和靶向PCR技术,通过FR特异性识别,用于体外定量检测人体全血中叶酸受体阳性细胞。


叶酸是肿瘤细胞在生长增殖过程中合成DNA的必要因素,肿瘤细胞通过叶酸受体(FR)摄取叶酸。因此,各类肿瘤细胞表面抗原高表达FR。所以,可以通过FR识别肿瘤细胞。


研究表明,FR在多种癌症中高度表达,是检测的有效靶点,应用于肿瘤诊疗各个阶段。


如:乳腺癌组织的FR阳性率为32%-80%、肺癌组织中FR阳性率为78%。


经临床大数据验证,FR+CTC兼具高灵敏度和高特异性,可以提高肿瘤早期发现率,有效监测治疗及预后预测,是实现肿瘤精准诊疗非常有价值的工具。


图源:邵春奎演讲PPT





小结

液体活检在肿瘤的早期发现和精准检测中具有极大的应用前景。CTC是目前液体活检临床研究的热点,也显示出强大的应用潜能。随着人们对CTC的研究不断深入,越来越多公司铆足干劲研发CTC产品,各种新型的CTC检测手段将不断出现。


相信在不久的将来,CTC可以翻越面前的拦路大山,成为肿瘤早筛、判断患者复发和预后价值的一大利器。

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