科研成果 I 基于ctDNA突变检测揭示非霍金奇淋巴瘤突变特征

早筛网讯：近日，由福建医科大学附属协和医院，福建省第三人民医院血液病研究团队与翱锐生物合作，运用翱锐生物自主研发的淋巴瘤检测Panel（励可安）对非霍金奇淋巴瘤患者组织和血液游离DNA进行检测，揭示血液ctDNA检测能识别出与肿瘤组织一致的高频基因突变。研究团队进一步分析了这些基因突变对预后的指导意义。

同时，分析了17例患者治疗前后ctDNA的动态变化，探索潜在的治疗靶点。相关研究结果发表在 European Journal of Haematology 杂志，题为“Mutation profiling of circulating tumor DNA identifies distinct mutation patterns in non-Hodgkin lymphoma”。

非霍金奇淋巴瘤（简称NHL），是一种组织学类型、临床表现以及生物学行为有显著异质性的淋巴细胞肿瘤性疾病。NHL复杂的亚型多样性由差异的基因组所决定。近年来，淋巴瘤的诊断和治疗已经进入了“精准医学”时代，了解NHL的基因组改变有助于识别出诊断和治疗的分子生物标志物。在实现癌症个性化治疗的道路上，下一代测序（NGS）技术发挥着不可取代的作用，NGS通过广泛的基因筛查，解码癌症的基因变异信息，预测癌症的复发风险，帮助医生确定癌症不同亚型的个体化疗法。由于组织样本取样的有创性和异质性，限制了NGS连续监测患者基因组变异信息的可能。近些年，液体活检技术应运而生，具有取材便利，克服肿瘤异质性，便于动态监测的特点，从而广泛的用于预测转移复发风险、研究耐药机制等。

虽然一些研究报道了NHL亚型的循环肿瘤DNA(ctDNA)的突变特征，但使用肿瘤组织和血液样本同时来识别NHLs亚型突变谱特征的研究很少。本研究通过分析肿瘤组织和血浆游离DNA(cfDNA)样本的基因突变谱，识别了各亚型特异的高频突变基因。此外，评估了基于ctDNA的肿瘤突变负荷（TMB）与临床病理特征的关系，并比较了NHL患者化疗前后ctDNA的突变改变，以期探索基线NHL不同分期和亚型间ctDNA肿瘤突变负荷的差异和耐药突变位点，从而指导个体化精准治疗。

纳入人群

该研究纳入了在2018年2月1日至2020年7月30日期间，临床病理诊断为NHLs的42例患者，其中DLBCL（25例，60%%），MCL（5例，12%）和T细胞淋巴瘤（7例，16.7%）。20例（47.6%）患者接受了一线R-CHOP方案治疗。

本文利用翱锐生物自主研发的淋巴瘤Panel检测了42个配对肿瘤组织（gDNA）和血液样本（ctDNA）中的体细胞突变。总共在组织和血液样本中分别检测到362和361个体细胞突变，其中94个基因在两类样本均能检测到突变，40个基因相关的209个突变仅在血样样本中检测到。在组织样本中，前5位高频突变基因分别是TTN（36%），KMT2D (26%), PCLO (24%), IGLL5 (19%)和PIM1 (19%)（图1A），在外周血样本中，前五位高频突变基因分别是KMT2D (60%), NCOR2 (52%), CEBPA (45%)，MUC16 (45%), 和PCLO (45%)（图1B）。比较组织和血液样本中前30位突变基因，不仅发现了16个共有基因具有可比的变异等位基因频率（VAF），而且组织和血液样本的平均VAFs具有显著相关性。这些发现表明ctDNA可以作为组织肿瘤基因组标记物的替代。此外，本研究还发现了一些亚型偏好的突变基因。例如，PIM1和MYD88为DLBCL亚型中高频突变基因，而在NK/T样本未检测出突变。

2）基于ctDNA的bTMB与临床病理特征的关联分析

肿瘤突变负荷是一项可定量的新兴肿瘤潜在生物标记物，用来反映肿瘤细胞中所含有的突变数目。本研究统计了组织和血液样本中肿瘤细胞每百万碱基的非同义突变数作为tTMB和bTMB。结果发现42个配对基线组织和血样样本的tTMB和bTMB存在一定程度的正相关（图2A）。此外，虽然研究未发现不同患者疾病进程和亚型间存在显著的bTMB差异，高侵袭B细胞淋巴瘤患者基线样本的bTMB高于惰性B细胞淋巴瘤的bTMB（图2B），且疾病进展患者的bTMB值高于治疗缓解的患者的bTMB（图2D）。

3）突变基因调整的IPI对NHL具有更佳的预后性能

国际预后指数（IPI）是目前广泛应用于NHL的预测指标。本文综合了患者的临床特征包括年龄、分期、结外侵犯部位数、血清乳酸脱氢酶水平等将患者分为低危（0-1），中低危（2），中高危（3）和高危（4-5）四个危险组。鉴于有时临床观察具有相同IPI评分却有不同的预后，本文研究调查了是否一些基因突变能够提高IPI模型对NHL的预后性能。研究发现在基线血液样本的前30位突变基因中，EP300 (P=0.032), CD79B (P=0.038)和PIM1 (P=0.012)突变患者的OS明显较短，而NCOR2 (P=0.014)突变患者OS明显较长。此外，IGLL5 (P=0.0071)突变患者的PFS明显较短，而CEBPA (P=0.042)突变患者PFS明显较长（图3）。进一步研究将这些与患者OS和PFS相关的基因突变纳入到IPI模型中，调整后的IPI模型的一致性指数（C-index；OS: 0.85; PFS: 0.84）均显著高于优化前的值(OS: 0.67; PFS: 0.66）。

4）治疗前后ctDNA中基因组改变和药物抵制点识别

除了基线样本ctDNA的相关研究外，本研究同时对17个NHLs患者的治疗前后ctDNA变化进行了动态监测。（图4）展示了治疗前后前30位突变基因图谱。研究发现治疗后样本突变数（176）远远大于基线样本突变数（63），尤其是DLBCL样本。进一步研究分析了11例接受R-CHOP治疗DLBCL患者治疗前后在13个已报道与淋巴瘤发展相关基因上的VAFs变化。研究发现了一些耐药相关的基因突变，如：CDKN2A（p.A127T）, KMT2A, PIM1, NCOR2和TTN，和一些药物靶标基因如CEBPA, MYD88和PCLO（p.L1220Tfs*3）（图5）

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